EAT. Чудинова, В.А. Платонов, А.В. Александрова, С.Н. Эланский
Жакында эле Ilyonectria crassa аскомицет грибогу картошканын түйүнүнө кол салууга жөндөмдүү экени көрсөтүлдү. Бул эмгекте биринчи жолу картошкадан бөлүнүп алынган I. crassa штаммынын биологиялык өзгөчөлүгү жана айрым фунгициддерге туруктуулугу анализденген. «Картошка» штаммынын түргө тиешелүү аймактарынын тизмеги мурда нарцисс, женьшень, көктерек жана буктун, лилия гүлдөрүнүн жана жоогазындын жалбырактарынан бөлүнүп алынган козу карындар үчүн алынган аймактар менен дал келген. Сыягы, көптөгөн жапайы жана бакча өсүмдүктөрү I. crassa үчүн корук боло алат. Изилденген штамм помидор менен картошканын кесиндилерин жугузуп алган, бирок бүтүндөй помидор жемиштерин же бүтүн картөшкөнүн түбүн жугузган эмес. Бул I. crassa жара мите экенин көрсөтүп турат. Флудиоксонилге, дифеноконазолго жана азоксистробинге аш болумдуу чөйрөдө туруктуулукту баалоо бул препараттардын жогорку натыйжалуулугун көрсөттү.
EC50 индикатору (фунгициддик эмес контролго салыштырмалуу колониянын радиалдык өсүү темпинен 2 эсеге жайлатуучу фунгициддин концентрациясы) 0.4кө барабар болгон; 7.4 жана 4 мг/л. Картошканын түптөрүн фитопатологиялык жактан баалоодо жана өсүмдүктөрдү коргоо чараларын иштеп чыгууда I. crassa козгогон оорунун пайда болуу мүмкүнчүлүгүн эске алуу керек.
Фитопатогендик микроорганизмдердин өнүгүшү картошканы өстүрүүнүн жана сактоонун бардык этаптарында чоң жоготууларга алып келет. Коргоо чараларын пландаштырууда, эреже катары, белгилүү патогендик микроорганизмдер эске алынат, мисалы, Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora ж.б. картошкада жаңы фитопатогендүү микроорганизмдердин пайда болушу жөнүндө. Алардын биологиясы начар изилденген, аларга каршы картошкага колдонулган фунгициддердин эффективдүүлүгү белгисиз, диагностикалык методдору иштелип чыккан эмес. Алар массалык түрдө иштелип чыкканда, картошканын түшүмүнө олуттуу зыян келтирүүгө жөндөмдүү. Бул микроорганизмдердин бири аскомицет козу карындары Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, биринчи жолу авторлор тарабынан картошканын түйүндөрүндө ачылган (Чудинова ж.б., 2019).
Бул эмгекте картошканын түбүнөн бөлүнүп алынган I. crassa штаммынын анализинин натыйжалары берилген. I. crassa колонияларынын жана мицелиалдык структураларынын морфологиясы, түргө тиешелүү ДНК бөлүмдөрүнүн нуклеотиддик ырааттуулугу, картошка менен помидордун вируленттүүлүгү, кээ бир популярдуу фунгициддерге туруктуулугу изилденген.
Материалдар жана ыкмалар
Бул иште колдонулган штамм — 18-жылы Кострома облусунда өстүрүлгөн ылаңдаган картөшкө түптөрүнөн бөлүнүп алынган I. crassa 2KSuPT2018. Түйнөк ачык күрөң мицелий менен капталган көңдөйү бар кургак чириктен жабыркаган. Стерилдүү кесүүчү ийнени колдонуу менен грибок мицелиясын агар чөйрөсү (сыра 10%, агар 1.5%, пенициллин 1000 даана/мл) бар Петри табагына көчүрдү. Идиштер караңгы жерде 24°С температурада инкубацияланган.
Сүрөткө тартуу, споралардын жана спора түзүүчү органдардын өлчөмүн жана морфологиясын баалоо үчүн ICC2500 HD санарип камерасы бар Leica DM50 жарык микроскобу жана IC80HD санарип камерасы бар Leica M80 бинокулярдык микроскобу (Leica Microsystems, Германия) колдонулган.
ДНКны изоляциялоо үчүн козу карын мицелиясын суюк буурчак чөйрөсүндө өстүрүштү, андан кийин суюк азотто тоңдурушту, гомогенизациялашты, CTAB буферинде инкубациялашты, хлороформ менен тазалашты жана эки жолу 2% спирт менен жуушту.
ДНКны экстракциялоо ыкмасы Кутузованын жана башкалардын макаласында кеңири баяндалган. (2017).
Түрдүн идентификациясын молекулярдык методдор менен аныктоо жана I. crassaнын башка белгилүү штаммдары менен салыштыруу үчүн ПТР түргө тиешелүү ДНК аймактарын күчөтүүгө мүмкүндүк берген праймерлер менен аткарылды: ITS1-5,8S-ITS2 (праймерлери ITS5/ITS4, White et al., 1990), б гендердин аймактары -тубулин (Bt2a/Bt2b, Glass and Donaldson, 1995) жана котормо узартуу фактору 1α (tef1α) (праймерлер EF1-728F/EF1-986R, Carbone жана Kohn, 1999). Керектүү узундуктагы ампликондор Evrogen компаниясынан CleanUp комплектинин жардамы менен гелден алынган. Кеңейтилген аймактар BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) аркылуу Applied Biosystems 3730 xl автоматташтырылган секвенсеринде (Applied Biosystems, CA, АКШ) ырааттуулук менен тизилди. Алынган нуклеотиддердин тизмеги АКШнын Биотехнологиялык маалымат боюнча Улуттук борборунун (NCBI) GenBank маалымат базасында дал келүүнү издөө үчүн колдонулган. Филогенетикалык анализ MEGA 6 программасын колдонуу менен жүргүзүлгөн (Тамура ж.б., 2013).
Вируленттүүлүгүн аныктоо чоң мөмөлүү помидордун (Дубрава сорту) жана картошканын (Гала сорту) бүтүндөй жашыл жемиштеринен жүргүзүлгөн. Мындан тышкары, бузулган жемиштердин жана түйүндөрдүн зыянын имитациялоо үчүн ошол эле мөмөлөрдүн жана түйүндөрдүн кесиндилери колдонулган. Тубер кесимдери нымдуу камераларга, түбүндө нымдуу чыпкалуу кагазы бар Петри табактарына салынган. Кагазга айнек слайд жайгаштырылып, ага өз кезегинде түйүндөрдүн же мөмөлөрдүн кесиндилери коюлган. Бүтүн тамырлар жана мөмөлөр да түбүнө нымдуу чыпка кагазы бар идиштерге салынган. Грибок гифасы бар агардын кесимчеси (5×5 мм) сусло агарында 5 күн культивациялангандан кийин тилимдин ортосуна (же түйүнчөктүн же мөмөнүн бүтүн бетине) грибок гифасы менен жайгаштырылган.
Грибок штаммдарынын фунгициддерге туруктуулугу агар азыктандыруучу чөйрөдө лабораториялык шарттарда бааланган. Максим, КС (активдүү ингредиент fludioxonil, 25 г/л), Quadris, KS (азоксистробин 250 г/л), Skor, CE (дифеноконазол 250 г/л) фунгициддик дарыларга сезгичтигин изилдедик (Мамлекеттик каталог..., 2020-ж. ). Баалоо 0.1 активдүү заттын концентрациясында изилденген препараттарды кошуу менен сусло-агар чөйрөсүндө Петри таякчаларында жүргүзүлгөн; 1; 10 промилле (мг/л) (флудиоксонил жана дифеноконазол үчүн), 1; 10; 100 ppm (азоксистробин үчүн) жана фунгицидсиз чөйрөдө (контроль). Фунгицид эриген чөйрөгө кошулуп, 60 °C чөйрөгө чейин муздатылган, андан кийин чөйрө Петри идиштерине куюлган. Петри табагынын ортосуна грибок мицелийи бар агар блогу коюлуп, караңгыда 24°С температурада культивацияланган. 7 күн инкубациялоодон кийин колониялардын диаметрлери эки өз ара перпендикуляр багытта өлчөнгөн; ар бир колония боюнча өлчөө натыйжалары орточо алынган. Эксперименттер нускада жасалган. Сыноонун натыйжаларынын негизинде EC50 индекси фунгициддик эмес контролго салыштырмалуу колониянын радиалдык өсүү ылдамдыгын эки эсе азайткан фунгицид концентрациясына барабар эсептелген.
Жыйынтыктары жана талкуулоо
Султон агары кошулган Петри табактарында кычыткы ак кабык мицелий менен колонияларды түздү. Мицелийдин астындагы чөйрө кызыл-күрөң болуп калды. Коргоочу чөйрө кургаганда, козу карындар бир конидиофорлордо споралардын эки түрүн жана майда спородохийге топтолгон спораларды пайда кылышкан. Макроконидиялар узун, цилиндр формасында, бирден үчкө чейин септалуу, орточо узундугу 27.2 мкм, диапазону 23.2ден 32.2 мкмге чейин, туурасы 4.9 мкмге чейин (1-сүрөт). Микроконидиялардын орточо узундугу 14.3 мкм, диапазону 10.3төн 18.1 мкмге чейин, туурасы 4.0 мкмге чейин. Бардык макро- жана микроморфологиялык белгилер Ilyonectria crassa түрүнүн вариация диапазонуна кирет (Cabral et al., 2012).
Түргө тиешелүү ДНК аймактарынын ырааттуулугу (ITS, b-tubulin, TEF 1α) биз мурда изилдеген I. crassa штаммдарынын ырааттуулугу менен толугу менен дал келди (Чудинова ж.б., 2019, 1-таблица). Башка региондордо I. crassa таралышын изилдөө жана жабыркаган өсүмдүктөрдүн спектрин талдоо максатында GenBank маалымат базасында окшош ДНК ырааттуулугу талдоого алынган (1-таблица). Кайталануу 86% дан 100%га чейин өзгөрдү. I. crassaнын “картошка” штаммынын бардык үч ДНК аймагынын тизмеги Нидерландиядагы лилия гүлдөрүнөн жана нарцисс тамырларынан жана Канададагы женьшень тамырынан бөлүнүп алынган штаммдардын ырааттуулугу менен бирдей болгон. Биз ачык маалымат базаларында үч талданган окшош ырааттуулугу менен башка I. crassa штаммдарын таба алган жокпуз. Бирок, депонирленген ITS жана b-тубулин тизмегинин анализи Улуу Британияда жоогазын жалбырактарында I. crassa бар экендигин аныктаган. ITS ырааттуулугуна окшош козу карындар Канадада көктөлөк тамырларынын жана Италияда буктун, Сауд Аравиясында картошканын түптөрүнүн микобиотасын талдоодо аныкталган (1-таблица). Бул изилдөөнүн натыйжалары I. crassa глобалдуу таралышы жана ар кандай өсүмдүктөрдүн түрлөрүнө кол салууга жөндөмдүү экенин көрсөтүп турат.
5-күнү помидордун жана картошканын кесиндилеринин патогендүүлүгүн аныктоодо жаранын диаметри 1.5 смге жеткен.Ошол эле учурда изилденген штамм помидордун бүтүндөй мөмөсүнө же бузулбаган картошканын түйүнүнө чалдыккан эмес. Бирок помидордо сепалалардын бузулушу байкалган. Булгануу мүмкүнчүлүгүн болтурбоо үчүн грибоктун изоляты картошканын бир кесиминде пайда болгон мицелиядан таза культурага бөлүнүп алынган. Бул ата-эне штаммына толугу менен окшош болгон. I. crassa жаралуу мите сыяктуу көрүнөт.
Фунгициддер менен урук түйүндөрүн отургузуу алдында дарылоо вегетация мезгилинде өсүмдүктөрдүн ооруларынын өнүгүшүн азайтат. Натыйжалуу фунгициддерди тандоо үчүн алардын кайсынысы I. crassaга каршы эффективдүү экендигин баалоо маанилүү. Иште фунгициддердин кеңири колдонулган активдүү ингредиенттери – флудиоксонил, азоксистробин, дифеноконазол изилденген. Fludioxonil отургузуу алдында уруктарды жана урук түйүндөрүн дарылоо үчүн колдонулган бир нече аралаш препараттардын бир бөлүгү болуп саналат. Fludioxonil (Максим) ошондой эле сактоо алдында урук түйүндөрүн дарылоо үчүн колдонулат. Дифеноконазол жана азоксистробин үрөн материалын кайра иштетүү үчүн колдонулган бир катар препараттарга, ошондой эле вегетативдик өсүмдүктөрдү кайра иштетүүгө арналган препараттарга кирет (Мамлекеттик каталог..., 2020-ж.).
I. crassa өсүү темпи ар кандай активдүү ингредиенттердин концентрациясы бар чөйрөдө (2-сүрөт) изилденген: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm) жана дифеноконазол (EC50 = 7.4 ppm) (2-таблица). . Бул дары-дармектерди I. crassaга каршы жогорку эффективдүү деп эсептесе болот, анткени алардын EC50и тамырларды дарылоо үчүн колдонулган жумушчу суюктуктагы сунушталган дары концентрациясынан кыйла төмөн. Мамлекеттик каталогдун маалыматы боюнча... (2020-жыл) картөшкө түйүндөрүн дарылоо үчүн суюктуктагы флудиоксонилдин концентрациясы 500дөн 1000 промиллеге чейин, азоксистробин (бороздун түбүн тазалоо үчүн суюктукта) – 3750–9375 промилле, дифеноконазол (өсүмдүк өсүмдүктөрдү дарылоо үчүн суюктукта) – 187.5– 625 промилле.
Таблица 1. Генбанк маалымат базасында жеткиликтүү 18KSuPT2 штаммынын жана Ilyonectria crassa штаммдарынын түргө тиешелүү ырааттуулугу ортосундагы ырааттуулук окшоштугу
Штаммды | Кожоюн өсүмдүк, бөлүп чыгаруучу жер | GenBankка сакталган катар номерлери, окшоштуктардын пайызы | байланыш | ||
ЖЖБИ | β-тубулин | TEF 1α | |||
17KSPT1 жана 18KSuPT2 | Картошканын тубу, Кострома областы. | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Чудинова ж.б., 2019, бул эмгек |
CBS 158/31 | Нарцисс тамырлары, Нидерланды | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral et al., 2012 |
CBS 139/30 | Лилия лампочкасы, Нидерланды | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Женьшень тамыры, Канада | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735/725 99.6 |
|
RHS235138 | Жоогазын жалбырагы, Улуу Британия | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Дентон, Дентон, 2014 |
MT294410 | Аспен тамырлары, Канада | MT294410 100 | ND | ND | Рамсфилд ж.б., 2020 |
ER1937 | Бук, Италия | KR019363 99.65 | ND | ND | Тицзани, Хеги, Мотта. Түздөн-түз берүү |
KAUF19 | Картошка түбү, Сауд Арабиясы | HE649390 98.3 | ND | ND | Гашгари, Гербави, 2013 |
ND = сакталган эмес
Таблица 2. Ilyonectria crassa фунгициддерге туруктуулугу
(активдүү зат) | EC50, ppm | ||||
3 күнү | 5 күнү | 7 күнү | |||
башкаруу | 17 ± 2 | 33 ± 5 | 47 ± 3 | ||
Quadris, KS (fzoxystrobin) | 18 ± 1 | 34 ± 2 | 48 ± 2 | ||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
11 ± 1 | 11 ± 1 | 12 ± 1 | |||
Максим, КС (флюдиоксонил) | 16 ± 1 | 28 ± 2 | 48 ± 2 | ||
7 ± 1 | 13 ± 3 | 19 ± 4 | |||
5 ± 1 | 12 ± 1 | 17 ± 5 | |||
Упай, EC (дифеноконазол) | 18 ± 1 | 35 ± 2 | 48 ± 1 | ||
11 ± 1 | 24 ± 3 | 35 ± 4 | |||
11 ± 1 | 13 ± 1 | 17 ± 3 |
Биздин ишибизде Кострома жана Москва облустарында I. crassa штаммдары картошканын түптөрүнөн бөлүнүп алынган (Чудинова ж.б., 2019). I. crassa менен окшош ITS ырааттуулугу бар грибок штаммдарынын жогорку үлүшү Сауд Аравиясында картошканын түптөрүнүн микобиотасын талдоодо аныкталган (Gashgari and Gherbawy, 2013). Сыягы, I. crassa картөшкө сейрек кездешпейт. Биздин эксперименттер кычыткы бузулган помидор жемиштерди жугузушу мүмкүн экенин көрсөттү. Адабияттан I. crassa топуракта сапротрофиялык өнүгүүгө жөндөмдүү экени белгилүү (Moll et al., 2016), ошондой эле ар түрдүү өсүмдүктөрдү, атүгүл таксономикалык жактан алыскы наргис, лилия, женьшень, ж. көктөлөк жана бук (1-таблица). Сыягы, көптөгөн жапайы жана бакча өсүмдүктөрү I. crassa үчүн корук боло алат. Жогоруда айтылгандар коргоо чараларын иштеп чыгууда бул козу карындын картөшкө түйүндөрүнө зыян келтирүү мүмкүнчүлүгүн эске алуу зарыл экенин көрсөтүп турат. Флудиоксонил, азоксистробин жана дифеноконазолду камтыган картошканын түптөрүн дарылоо үчүн кеңири колдонулган препараттар I. crassaга каршы жогорку фунгициддик эффективдүүлүктү көрсөттү.
Иш Россиянын фундаменталдык изилдөөлөр фонду тарабынан колдоого алынган (грант №20-016-00139).
Макала “Өсүмдүктөрдү коргоо жарчысы” журналында жарыяланган, 2020, 103(3)